本发明提供了一种无抗性标记营养缺陷型鲁式酵母的制备方法。该技术方案首先分析了鲁式酵母的URA表达基因，分别针对其CDS序列的上游片段和下游片段设计引物，以鲁式酵母总DNA为模板扩增得到目的片段后，分别与pMD19‑T载体连接，再以重组质粒为模板、使用Pfu酶分别扩增，得到上、下游片段。在此基础上，通过融合PCR手段将上、下游片段连接，从而得到了去除URA基因的CDS区域的敲除载体，基于该同源重组片段，本发明利用pMD19‑T载体构建重组质粒，而后通过PEG‑醋酸
锂方法转化野生型菌株，对转化产物先以限制性培养基初筛，再通过PCR方法直接验证，最后用含梯度浓度5’‑FOA的培养基进一步验证。本发明所构建的工程菌具有严格的URA营养缺陷特征，同时遗传稳定性良好。
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来源：北方有色网
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