摘要：微生物种类在生物冶金的过程中具有重要的作用,但是传统的培养方法已不能满足于生物冶金研究的需要,随着现代科学技术的发展,荧光原位杂交（FISH）技术被越来越广泛的使用。FISH技术是一种不依赖于培养的微生物检测技术,具有高度安全性和敏捷性,主要用来检测矿中微生物的形态、数量和空间分布情况的一种现代分子生物学方法。本文主要介绍了荧光原位杂交（FISH）技术的原理、主要试剂、实验仪器、浸矿菌的固定方法和原位杂交过程,同时对FISH技术在生物冶金中的应用和前景进行了展望。
关键词：生物冶金 荧光原位杂交 环境微生物 浸矿菌
基金项目：基于FISH技术的细菌-硫铁矿的吸附机制研究（项目编号：2021GX099）。
作者简介：王利沙（1984—）,女,硕士,主要从事教学工作。
李平（1978—）,女,碩士,主要从事教学工作。
赵洪侠（1986—）,女,硕士,主要从事教学工作。
Application of Fish Technology in Bioleaching
WANG Lisha ,LI Ping ,ZHAO Hongxia
（Weifang Nursing ocational College, Weifang, Shandong Province, 261000,China）
Abstract： Microbial species play an important role in the process of bioleaching, but the traditional culture methods can not meet the needs of bioleaching research. With the development of modern science and technology, fluorescence in situ hybridization （FISH） technology is more and more widely used. FISH technology is a microbial detection technology independent of culture, with high safety and agility. It is mainly used to detect the morphology, quantity and spatial distribution of microorganisms in mines. This paper mainly introduces the principle, main reagents, experimental instruments, fixation method of ore leaching bacteria and in situ hybridization process of FISH technology are introduced. At the same time, the application and prospect of FISH technology in bioleaching are prospected.
Key Words： Bioleaching, fluorescence in situ hybridization （FISH）, environmental microorganism, leaching bacteria
生物冶金是利用微生物技术通过多种反应途径对矿物进行氧化分解,再进行纯化、富集、浓缩等,最终从矿物中浸出目标金属的过程,也是涉及冶金、生物、矿物等多学科的一种微生物冶金技术。该技术具有以下优势：反应温和、工艺过程简单、流程少、对环境友好、资源的利用率高等[1-3],因此被广泛应用在
湿法冶金、环境工程、矿物加工等领域。目前,微生物冶金技术也面临着一些问题亟需解决,例如：微生物浸出过程的优化与控制,在极端条件下对浸矿菌株的高效选育、生物冶金领域的拓展等。传统的微生物冶金研究方法,容易忽略生物间的相互作用和气候变化的影响,所得出的试验结果也不能真实的反映自然条件下微生物的空间分布、风度和生物多样性等,因此具有很大的局限性,也限制了我们对浸矿菌株的开发和利用,因此亟需研究一种简便的检测方法,对浸矿微生物进行快速的鉴定和检测。
现代分子生物学技术与传统微生物学方法相比,能够有效地促进和提高浸矿微生物的检验精确度和微生物的种类。随着技术的发展,可以直接鉴定微生物的技术包括酶检测技术、核酸探针检测和免疫学检测技术等,较为常用的分子生物技术包括限制性片段长度多态性分析技术（RFLP）、X射线光电子能谱分析（XPS）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、荧光定量PCR技术和荧光原位杂交技术（FISH）等。其中FISH是一种不依懒于培养的非放射性的微生物检测技术,由于该技术具有安全、探针稳定、准确度和灵敏度高、杂交特异性好、能有多种颜色显示等优点,可以更加直观地检测出微生物在矿物表面的数量和分布[4-6],因此近年来在环境微生物学、湿法冶金技术研究领域逐渐被广泛使用。该文主要对FISH在检测矿物中的微生物技术作以简单介绍。
1 荧光原位杂交技术（FISH）简介
FISH技术具有高度的灵敏性、准确的定位、比较短的试验周期及较强的特异性,FISH采用的是荧光探针,比较的稳定且经济,该技术采用高度灵敏度
检测仪器,如具有较高强度图像的共焦激光扫描显微镜的使用,方便微生物计数的电荷耦合相机（CCD）和便于图像数字化的图像分析软件,分析自动化的流式细胞仪等,增加了FISH技术的高灵敏度分析能力。
FISH技术是采用荧光标记的特异寡核苷酸序列作为探针,根据碱基互补配对原则,经过变性、退火、变性过程,探针与细胞内相应的靶RNA 分子或 DNA 分子的杂交,在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下通过观察荧光的信号,来确定与特异探针杂交后微生物的形态、数量和分布[7]。目前,FISH技术主要采用高度保守的16S rRNA来设计寡核苷酸探针,进而实现对相应菌株的原位检测。采用rRNA来设计探针具有以下优势：（1）16S rRNA在微生物体内具有很高的拷贝数,不同种类的微生物的相对序列保守型不同,进而设计特异性的探针,不同种、属等水平上进行荧光检测,（2）16S rRNA在微生物中分布广泛且功能稳定,可以极大的提高检测的灵敏性。
2 ,FISH技术的相关步骤
2.1主要试剂
（1）PBS缓冲液：30mM ,NaCl、7 mM ,Na2HPO4、3 mM ,NaH2PO4,调节pH 为7.2.
（2）4%多聚甲醇溶液：加热的33mL高纯水,2g多聚甲醇,16.5mL的PBS缓冲液,室温条件冷却后,调节溶液pH为7.2。
（3）明胶溶液：明胶,KCr（SO4）2﹒12H2O。
（4）DAPI复染液：1 g DAPI和1 mL灭菌双蒸水配成溶液,低温下保存。
（5）杂交溶液：1M ,pH8.0的 ,Tris/HCl ,5M的NaCl溶液,10%的SDS溶液,双蒸水和甲酰胺。注意：配制杂交液的时候,要根据杂交液中甲酰胺的百分含量。
（6））洗脫液：1M ,pH8.0的 ,Tris/HCl ,5M的NaCl溶液,10%的SDS溶液,0.5M ,EDTA,双蒸水。注意：洗脱溶液中的NaCl溶液的浓度随着杂交液中的甲酰胺浓度而发生相应的变化。
2.2浸矿菌的固定
一般常用的固定方法为多聚甲醛固定法。取菌液100 mL,在4 ℃ 11 000 r/min离心8 min,弃上清液备用,再用灭过菌的PBS溶液洗涤菌液2次,弃去上清液后加入10 mL灭过菌的PBS溶液和30 mL 4%的多聚甲醛固定液制成菌体悬浮液,置于冰上固定3 h,4 ℃ 11 000 r/min离心8 min,弃上清液用30 mL灭过菌的PBS溶液洗涤、离心（11 000 r/min）,再加入30 mL的PBS溶液和30 mL的在冰上预冷的乙醇制成菌体悬浮液,最后将处理好的菌体储存在冰箱中（-20 ℃）备用。
2.3原位杂交
用移液枪吸取10 μL固定好的菌液加到经明胶处理好的载玻片上,室温下晾干,依次用50%,80%和96%的乙醇溶液洗涤、脱水,空气中干燥,再将配置好的杂交液滴在载玻片上,并盖盖玻片,于46 ℃进行杂交1.5～2.0 h,在黑暗条件下,用洗脱液进行洗涤,并用DAPI溶液对菌液进行复染,在室温下晾干在荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜等进行显色观察浸矿菌的形态、数量及分布。
2.4 注意事项
（1）在原位杂交技术中,要设计合适的、便于观察的探针,因为探针的特异性将会直接影响FISH技术的观察结果。
（2）在处理微生物样品的过程中,要进行规范操作,微生物的固定、消毒灭菌、黑暗操作条件等要严格处理,保证实验结果的准确性。
（3）在用洗脱液对样品进行洗脱处理的2898f62d3039d6948f0715fd5aa46c06时候,一定要掌握好时间和尺度,防止出现假阳性或者假阴性,进而影响实验结果。
FISH技术在微生物研究领域中的应用进展 3.1在环境微生物检测中的应用
FISH技术不需要培养所检测的微生物样品,可以直接检测样品中的微生物
种类、分布,进而实现对自然条件下的微生物进行原位检测,因此被官方应用于环境微生物学的研究中。主要表现在以下两个方面：（1）FISH技术在污水生物净化方面的应用。近年来,随着我们对除磷、脱氮机理的深入研究,FISH技术的引入解决了污水生态系统的微生物的适时动态监测、脱氮细菌和除磷菌的培养难等问题。（2）在难降解有机物功能降解菌的研究。国内外许多学者采用FISH技术成功客服了功能降解菌培养难的问题,通过荧光（如FITC、Cy5等）标记特异性探针,监测反应器中的好痒颗粒物机内的微生物空间分布及种类。
3.2在医学领域中的应用
由于FISH技术较高的敏感性和特异性,备受医学领域的广泛应用,能够提早的发现肿瘤细胞,并及时的进行治疗,大大提高了治疗的成功率[8]。例如：通过富集培养液基薄层细胞,并采用荧光原位杂交（FISH）技术来检测尿路上皮癌具有重要的应用价值,为临床医生的正确诊断提供参考[9]。
3.3在生物冶金领域的应用
FISH技术由于其自身的独特优势,除了在环境微生物、医学领域之外,在生物冶金领域也备受青睐。例如：利用FISH技术和实时荧光定量PCR技术（Q-PCR）能够快速且准确的检测新疆铀矿生物冶金中的细菌的数量、种类和空间定位,进而分析微生物群落结构的动态变化[10]。采用FISH方法分析微生物与黄铁矿的界面作用,通过专门设计Acidithiobacillus ferrooxidans和Leptospirillum ferrooxidans的荧光探针,检测黄铁矿表面细菌的吸附情况和空间分布[8]。
4 ,FISH技术在生物冶金中的应用前景
近年来,随着荧光原位杂交技术的高度特异性及其检测结果的灵敏性,使得FISH检测技术促使FISH技术在生物冶金领域、环境微生物学中被广泛应用,也极大的扩展了生物冶金技术的研究空间。荧光原位杂交技术能够弥补传统的微生物培养技术的缺陷,还能客观的反映微生物在实验室或自然条件下的数量及空间分布等,对于生物冶金的研究奠定了理论基础。
5 结语
尽管荧光原位杂交技术在生物冶金应用的过程中,会受到一些技术问题的困扰,例如：荧光信号弱、背景荧光强度高导致分辨率较低、对于生长缓慢的微生物细胞很难检测等一系列问题,但是FISH技术可以联合其他技术的应用,加上其高度的灵敏性,仍可以为微生物检测提供更多的信息,被广泛应用于环f147683a52635122377ae8f9429bba9c境微生物、湿法冶金等研究领域,对于深入、完整地进行生物冶金方面的理论研究具有重要的现实意义。
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编辑：北方有色网
来源：王利沙李平赵洪侠
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